De spanska erövrarens Don Nuño Beltrán de Guzmáns ständiga intrång mot de västra länderna i landet, för att öka hans herravälde och makt över dessa territorier, resulterade i upprättandet av en ny provins som kallades kungariket Nya Galicien.
Regionen beboddes av olika inhemska grupper, som ständigt härjade bosättningarna som spanska hade grundat i den. Nuño de Guzmáns löjtnant, kapten Juan B. de Oñate, fick order att lugna dessa provinser och att grunda Villa de Guadalajara på platsen som heter Nochistlán, ett faktum att han fullbordade den 5 januari 1532. Med tanke på täta inhemska attacker mot staden han var tvungen att flytta ett år senare till Tonalá och senare till Tlacotlán. En tredje överföring gjordes för att bosätta sig i Atemajac-dalen, där staden grundades definitivt den 14 februari 1542 med närvaro av Cristóbal de Oñate som guvernör i Nya Galicien och Don Antonio de Mendoza, då vicekonge i Nya Spanien, som utsåg Miguel de Ibarra borgmästare och löjtnantguvernör.
Staden utvecklades snabbt och började konkurrera med Compostela (idag Tepic), som då var säte för religiösa och civila makter, så att invånarna i Guadalajara utövade ett sådant tryck på Audiencias myndigheter, att kungen Felipe II beslutade att utfärda en Cédula daterad 10 maj 1560 för att flytta från Compostela till Guadalajara, katedralen, kungliga domstolen och statskassan.
Stadsstrukturen planerades enligt de andra koloniala städerna, så dess layout utvecklades i form av ett schackbräde från det som var San Fernando-torget. Senare grannskapen Mexicaltzingo och Analco grundades av Fray Antonio de Segovia och grannskapet Mezquitán, en av de äldsta. Stadshushusen uppfördes också mittemot det nuvarande templet San Agustín och den första församlingskyrkan där rättvisans palats ligger.
Idag uppvisar den magnifika staden, rik på koloniala byggnader, ett stort antal relevanta arkitektoniska exempel, som dess katedral, en måste-se plats, byggd mellan 1561 och 1618 av arkitekten Martín Casillas. Hans stil har klassificerats som begynnande barock. Dess solida struktur stiger framför dagens Plaza de Guadalajara med sina nyfikna torn som, även om de inte tillhör byggnadens ursprungliga stil, för närvarande erkänns som en symbol för huvudstaden i Guadalajara. De primitiva tornen förstördes under 1800-talet av en jordbävning, varför de som den har idag lades till. Interiören i templet är halvgotisk i stil, inklusive dess valv som är gjorda av spets.
Andra religiösa områden från 1500-talet är San Francisco-klostret, som grundades 1542 nära floden, i området Analco och nästan helt förstördes under reformationen. Dess tempel, som renoverades i slutet av 1600-talet, med sin barockfasad med blygsamma soloniska linjer, bevaras. Klostret San Agustín, grundades 1573 av kungliga förordningen om Felipe II och bevarar för närvarande sitt tempel med sin fasad av svåra herreriska linjer och dess interiör med räfflade valv.
Santa María de Gracia, en annan av de grundläggande stiftelserna, ockuperades av Dominikanska nunnor från Puebla, byggd 1590 framför Plaza de San Agustín och betalades av Hernán Gómez de la Peña. Konstruktionen kom att ockupera sex kvarter, även om det i dag bara består av ett tempel, med en nyklassisk fasad från andra hälften av 1700-talet.
